Μεταφορά ανασυνδυασμένου DNA

Όταν θέλουμε να εισάγουμε ένα γονίδιο σε βακτήριο, χρησιμοποιούμε μια διαδικασία που λέγεται μετασχηματισμός. Είναι σαν να "ντύνουμε" το DNA που μας ενδιαφέρει μέσα σε ένα πλασμίδιο για να μπορέσει να μπει στο βακτήριο.

Το ανασυνδυασμένο DNA περιέχει τόσο το γονίδιο που θέλουμε όσο και ειδικά γονίδια ανθεκτικότητας. Αυτά τα γονίδια ανθεκτικότητας είναι σαν "ταυτότητες" που μας βοηθάνε να αναγνωρίσουμε ποια βακτήρια πήραν το DNA που θέλαμε.

Σημαντικό: Ο μετασχηματισμός δεν επιτυγχάνει πάντα - μόνο μερικά βακτήρια θα πάρουν το πλασμίδιο που θέλουμε!

Επιλογή κυττάρων ξενιστών - Βασική αρχή

Αφού κάνουμε τον μετασχηματισμό, έχουμε μια "μίξη" από τρία διαφορετικά είδη βακτηρίων. Μερικά δεν πήραν καθόλου πλασμίδιο, άλλα πήραν πλασμίδιο χωρίς το γονίδιο μας, και άλλα πήραν το σωστό ανασυνδυασμένο πλασμίδιο.

Η επιλογή κυττάρων ξενιστών γίνεται με αντιβιοτικά. Τα πλασμίδια περιέχουν γονίδια που δίνουν ανθεκτικότητα σε αντιβιοτικά, οπότε μόνο τα βακτήρια που έχουν πλασμίδιο θα επιβιώσουν όταν προσθέσουμε αντιβιοτικό.

Συμβουλή: Σκέψου την ανθεκτικότητα σαν ένα "διαβατήριο" - χωρίς αυτό το βακτήριο δεν μπορεί να επιβιώσει στο περιβάλλον με αντιβιοτικό!

Πρώτο στάδιο επιλογής

Ξεκινάμε με μια υγρή καλλιέργεια που περιέχει και τα τρία είδη βακτηρίων. Όταν τα καλλιεργήσουμε σε τρυβλίο, θα δούμε αποικίες και από τα τρία είδη.

Προσθέτουμε στο θρεπτικό υλικό αμπικιλίνη (amp). Αυτό το αντιβιοτικό θα σκοτώσει όλα τα βακτήρια που δεν έχουν το γονίδιο ανθεκτικότητας amp^r.

Τα μη-μετασχηματισμένα βακτήρια δεν έχουν καθόλου πλασμίδιο, άρα δεν έχουν γονίδιο ανθεκτικότητας. Οι αποικίες τους εξαφανίζονται και μένουν μόνο όσα βακτήρια έχουν πλασμίδιο.

Προσοχή: Αυτό το στάδιο μας βοηθάει να ξεχωρίσουμε τα μετασχηματισμένα από τα μη-μετασχηματισμένα, αλλά όχι ακόμα το σωστό πλασμίδιο!

Δεύτερο στάδιο επιλογής

Τώρα πρέπει να βρούμε ποια από τα επιζήσαντα βακτήρια έχουν το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο με το γονίδιο που θέλουμε. Δημιουργούμε μια καλλιέργεια αντίγραφου - δύο πανομοιότυπες καλλιέργειες.

Στη μία καλλιέργεια προσθέτουμε στρεπτομυκίνη (str), το δεύτερο αντιβιοτικό. Τα βακτήρια με το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο έχουν χάσει το γονίδιο ανθεκτικότητας στη στρεπτομυκίνη, οπότε δεν θα αναπτυχθούν.

Συγκρίνουμε τις δύο καλλιέργειες: οι αποικίες που υπάρχουν στην πρώτη αλλά λείπουν από τη δεύτερη έχουν το γονίδιο που θέλουμε!

Έξυπνο κόλπο: Είναι σαν παζλ - ψάχνουμε τα κομμάτια που λείπουν από τη δεύτερη εικόνα!

cDNA βιβλιοθήκη - Επισκόπηση

Η cDNA βιβλιοθήκη είναι μια συλλογή από κλώνους που περιέχουν μόνο τα γονίδια που εκφράζονται σε έναν συγκεκριμένο ιστό. Ξεκινάμε από mRNA αντί για genomικό DNA γιατί το mRNA δεν περιέχει introns.

Η διαδικασία περιλαμβάνει τη δημιουργία υβριδίου mRNA-cDNA, την αποδιάταξη των αλυσίδων και την αντιγραφή για να φτιάξουμε δίκλωνο DNA. Στο τέλος έχουμε ανασυνδυασμένα βακτήρια που μπορούν να παράγουν πρωτεΐνες όπως την προινσουλίνη.

Γιατί είναι χρήσιμο: Με τη cDNA βιβλιοθήκη μπορούμε να παράγουμε ανθρώπινες πρωτεΐνες σε βακτήρια - έτσι φτιάχνεται η ινσουλίνη για διαβητικούς!

Δομή cDNA βιβλιοθήκης

Κάθε κλώνος στη cDNA βιβλιοθήκη αντιπροσωπεύει ένα διαφορετικό γονίδιο που εκφραζόταν στον αρχικό ιστό. Τα ανασυνδυασμένα πλασμίδια περιέχουν το cDNA εισαγμένο σε φορέα κλωνοποίησης.

Αυτή η τεχνική μας επιτρέπει να μελετήσουμε και να παράγουμε πρωτεΐνες που κανονικά παράγονται μόνο σε συγκεκριμένους ιστούς. Για παράδειγμα, μπορούμε να πάρουμε mRNA από πάγκρεας και να φτιάξουμε προινσουλίνη σε βακτήρια.

Κάθε βακτηριακή αποικία αντιπροσωπεύει έναν "τόμο" στη βιβλιοθήκη, όπου κάθε τόμος περιέχει τις οδηγίες για μία πρωτεΐνη.

Αναλογία: Σκέψου τη cDNA βιβλιοθήκη σαν μια πραγματική βιβλιοθήκη όπου κάθε βιβλίο είναι ένας κλώνος με διαφορετικό γονίδιο!

Σύνθεση cDNA από mRNA

Το mRNA χρησιμεύει σαν καλούπι για τη σύνθεση μιας συμπληρωματικής αλυσίδας DNA (cDNA). Αυτή η διαδικασία γίνεται από το ένζυμο αντίστροφη μεταγραφάση, που κάνει το αντίθετο από τη συνηθισμένη μεταγραφή.

Αντί να πάμε από DNA σε RNA, εδώ πάμε από RNA σε DNA! Η αντίστροφη μεταγραφάση "διαβάζει" το mRNA και φτιάχνει μια αλυσίδα DNA που του αντιστοιχεί.

Το αποτέλεσμα είναι υβριδικά μόρια cDNA-mRNA - δηλαδή μόρια που έχουν μια αλυσίδα RNA και μια αλυσίδα DNA κολλημένες μαζί.

Ενδιαφέρον γεγονός: Η αντίστροφη μεταγραφάση ανακαλύφθηκε στους ιούς και επανάστασε τη βιοτεχνολογία!

Δημιουργία δίκλωνου DNA

Στο επόμενο βήμα πρέπει να απαλλαγούμε από το mRNA και να δημιουργήσουμε πλήρως δίκλωνο DNA. Το mRNA διασπάται με χημικές ουσίες ή αποδιατάσσεται με θέρμανση.

Τώρα τα μονόκλωνα cDNA χρησιμεύουν σαν καλούπια για τη σύνθεση των συμπληρωματικών αλυσίδων DNA. Αυτή τη φορά χρησιμοποιούμε κανονική DNA πολυμεράση.

Το τελικό αποτέλεσμα είναι δίκλωνα μόρια DNA που περιέχουν μόνο τις κωδικές περιοχές των γονιδίων (χωρίς introns). Αυτό είναι ιδανικό για έκφραση σε βακτήρια.

Σημαντικό πλεονέκτημα: Τα βακτήρια δεν μπορούν να επεξεργαστούν introns, γι' αυτό το cDNA είναι απαραίτητο για την παραγωγή ανθρώπινων πρωτεϊνών!

Κλωνοποίηση και έκφραση

Τα δίκλωνα μόρια DNA εισάγονται σε πλασμίδια ή βακτηριοφάγους για κλωνοποίηση. Αυτή η διαδικασία μας επιτρέπει να πολλαπλασιάσουμε το γονίδιο που θέλουμε σε μεγάλες ποσότητες.

Τα ανασυνδυασμένα βακτήρια που προκύπτουν μπορούν να παράγουν την πρωτεΐνη του γονιδίου στον ξενιστή. Για παράδειγμα, βακτήρια E. coli μπορούν να παράγουν προινσουλίνη που στη συνέχεια μετατρέπεται σε ινσουλίνη.

Αυτός ο τρόπος επιτρέπει τη μαζική παραγωγή σημαντικών φαρμάκων με χαμηλό κόστος και υψηλή καθαρότητα.

Πρακτική εφαρμογή: Έτσι παράγεται σήμερα η ινσουλίνη για εκατομμύρια διαβητικούς παγκοσμίως - όχι από πάγκρεας ζώων αλλά από βακτήρια!

Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυμεράσης (PCR)

Η PCR είναι μια επαναστατική τεχνική που μας επιτρέπει να πολλαπλασιάσουμε συγκεκριμένα τμήματα DNA εκατομμύρια φορές σε λίγες ώρες. Χρησιμοποιεί πρωταρχικά τμήματα DNA που "αναγνωρίζουν" το τμήμα που θέλουμε να κλωνοποιήσουμε.

Η διαδικασία περιλαμβάνει αποδιάταξη του δίκλωνου DNA με θερμότητα, υβριδοποίηση των primers, και σύνθεση νέων αλυσίδων με DNA πολυμεράση. Αυτός ο κύκλος επαναλαμβάνεται 30-40 φορές.

Κάθε κύκλος διπλασιάζει την ποσότητα του DNA, οπότε από ένα μόριο μπορούμε να πάρουμε δισεκατομμύρια αντίγραφα!

Απίστευτο γεγονός: Η PCR είναι τόσο ευαίσθητη που μπορεί να εντοπίσει DNA από ένα μόνο κύτταρο - γι' αυτό χρησιμοποιείται στην εγκληματολογία!